Rejestracja Próbek
Logo MASDIAG

Sucha kropla krwi

Technika suchej kropli krwi (DBS, ang. dried blood spot) jest alternatywnym dla wkłucia żylnego sposobem pobrania krwi do badań diagnostycznych. Polega ona na nakłuciu opuszki palca lub piętki (w przypadku noworodków) i naniesieniu uzyskanej krwi włośniczkowej na nośnik stały w postaci specjalnej bibuły filtracyjnej. Nakłucie palca wykonuje się zazwyczaj przy użyciu jednorazowego lancetu. Krew pobraną na bibułę należy wysuszyć w pozycji poziomej (zazwyczaj 2-3h) w temperaturze pokojowej. Tak przygotowana, wysuszona próbka może być transportowana lub przeznaczona bezpośrednio do badań diagnostycznych.
Unikalne właściwości suchej kropli krwi to m.in.:
  • Niska inwazyjność
    Pobranie krwi z opuszki palca jest dobrą alternatywą dla osób ze słabymi żyłami czy posiadających zrosty po wielokrotnych pobraniach. Znajduje ona zastosowanie u osób starszych, otyłych lub ze słabo widocznymi żyłami, u których trudno jest dokonać wkłucia żylnego. Również aspekt psychologiczny odgrywa tu istotną rolę - pobranie DBS może być prostsze do przeprowadzenia u dzieci, osób niepełnosprawnych umysłowo czy u wszystkich obawiających się widoku igły i pobrania krwi żylnej.
  • Niewielka ilość materiału badanego
    W przypadku jednorazowego pobrania materiału z opuszki palca objętość pobieranej krwi zmniejsza się nawet 100-krotnie w stosunku do pobrania krwi żylnej. Do uzyskania wyniku o wysokiej dokładności i powtarzalności wystarczy kropla krwi o objętości 25-75 µl, co odpowiada plamie krwi na bibule o średnicy 8-14 mm. Fakt ten ma szczególne zastosowanie u noworodków, pacjentów w ciężkim stanie bądź osób wymagających stałej kontroli laboratoryjnej.
  • Możliwość pobrań w domu bądź przez niewykwalifikowany personel
    Pobranie DBS jest dobrym rozwiązaniem w przypadku pacjentów z obniżoną odpornością, dla których wizyta w punkcie pobrań może stanowić dodatkowe zagrożenie, a także dla osób z ograniczoną możliwością poruszania się. Ułatwia też znacznie prowadzenie badań przesiewowych na dużych populacjach w warunkach braku dostępu do specjalistycznego zaplecza medycznego.
  • Wysoka stabilność analitów
    Wysuszenie krwi na bibule hamuje lub nawet zatrzymuje przebieg procesów metabolicznych, co pozwala na uzyskanie dłuższej stabilności badanych związków w porównaniu do surowicy, osocza czy krwi pełnej pobranej do probówek.
  • Niska zakaźność w transporcie i obróbce
    Wysuszenie materiału powoduje dezaktywację wirusa HIV. Wirus HBV nie jest wprawdzie całkowicie niszczony, ale jego transmisja staje się niemożliwa i dopiero zawieszenie w cieczy może wiązać się z ryzykiem potencjalnego przeniesienia wirusa (tylko w przypadku, jeśli doszłoby do bezpośredniego przeniesienia zainfekowanej cieczy do krwiobiegu).
  • Łatwy i niewymagający transport/przechowywanie
    Pobrania w formie DBS w porównaniu z pobraniami żylnymi umożliwiają transport i przechowywanie większej ilości próbek z wykorzystaniem tej samej przestrzeni, zapewniają niższe zużycie energii oraz prowadzą do ograniczenia ilości odpadów, w tym odpadów z tworzyw sztucznych. Ryzyko uszkodzenia lub zanieczyszczenia próbek DBS jest minimalne. Poza zapakowaniem materiału w torebkę strunową z osuszaczem nie jest wymagane zapewnienie szczególnych warunków środowiskowych podczas transportu i przechowywania próbek.
Ograniczenia w wykorzystaniu suchej kropli krwi:
  • choroby związane z zaburzeniami hematokrytu (niedokrwistości, czerwienice)
  • ograniczona ilość badań opracowanych z suchej kropli krwi
  • konieczność posiadania specjalistycznej aparatury pomiarowej
  • potrzeba zatrudniania wysoce wykwalifikowanego personelu 
  • wydłużony czas oczekiwania na wynik (transport do i od pacjenta)
  • możliwe błędy w pobraniu:
    • - zbyt mała ilość materiału
    • - nieprawidłowa jakość materiału (wielokrotne nakładanie materiału w to samo miejsce, nieprawidłowe przesączenie, niewłaściwe warunki suszenia)
    • - możliwość zanieczyszczenia materiału w czasie pobierania (środki pielęgnujące skórę dłoni, zanieczyszczenia powierzchni).
Przeciwwskazania do pobierania materiału w formie DBS:
  • odwodnienie, przewodnienie
  • niskie ciśnienie krwi z zaburzeniami krążenia obwodowego
  • obecność zmian skórnych w postaci zgrubień, zrogowaceń, owrzodzeń lub pęcherzy w planowanym miejscu nakłucia
  • małopłytkowość lub nieprawidłowości w budowie płytek krwi, zaburzenia krzepnięcia
  • niedokrwistość i czerwienica
  • obecność obrzęków obwodowych
Należy pamiętać, iż w przypadku noworodków i dzieci poniżej 10 kg rekomendowanym miejscem nakłucia jest piętka. W przypadku nakłucia palca może dojść do uszkodzenia kości.
Kamienie milowe w rozwoju badań opartych na technice DBS

Pierwsze medyczne zastosowania suchej kropli krwi datuje się na początek XX wieku. W 1907 roku Ivar Christian Bang po raz pierwszy wspomniał o wykorzystywaniu krwi naniesionej na specjalny papier filtracyjny w badaniach stężenia glukozy. Pierwsza publikacja na ten temat pojawiła się w 1913 roku. Ostatecznie Bang został uznany za pioniera i twórcę współczesnej mikrochemii klinicznej.

Równolegle, w 1911 roku, Noguchi opracował wariację testu Wassermana. Badając obecność przeciwciał skierowanych przeciw Treponema pallidum (bakterii wywołującej kiłę) w surowicy pacjentów, wykorzystał bibułę filtracyjną jako nośnik dla antygenu, dopełniacza i hemolizyny (przeciwciał hemolizujących) celem wydłużenia stabilności tych odczynników w temperaturze pokojowej.

Do 1939 roku prowadzono już intensywne badania nad wykorzystaniem bibuł filtracyjnych jako podłoża do pobierania próbek na badania serologiczne. Ewaluację prowadzono dla różnych rodzajów bibuł, metod ekstrakcji, czynników zewnętrznych i stabilności materiału w transporcie.

Przełom lat 50. i 60. był znaczący dla badań opartych na suchej kropli krwi. W 1957 roku pojawiły się doniesienia o wykorzystaniu materiału pobranego na bibułę filtracyjną w diagnostyce wschodniego końskiego zapalenia mózgu. W tym samym roku po raz pierwszy zastosowano urządzenie do wycinania wystandaryzowanych krążków, a rok później wykorzystano bibułę do pobrania moczu w badaniach wczesnego wykrywania fenyloketonurii u noworodków. Natomiast lata 1961-63 zapoczątkowały nową erę badań przesiewowych. Opracowanie przez Roberta Guthrie w 1961 roku i opublikowanie w 1963 roku metody analitycznej umożliwiającej oznaczenie fenyloalaniny w suchej kropli krwi pozwoliło na prowadzenie badań na nieznaną wcześniej skalę.

Koniec lat 90. okazał się kolejnym przełomem w diagnostyce opartej na suchej kropli krwi. Pomysł wykorzystania tandemowej spektrometrii mas do wieloparametrowych analiz z jednego krążka bibuły otworzył nowe perspektywy przed badaniami przesiewowymi. Umożliwił oznaczenie szerokiej gamy analitów w czasie jednej analizy, znacząco skracając czas badań oraz - ze względu na wysoką stabilność analitów na bibule - skutkował możliwością obejmowania badaniami całych populacji.

Badania przesiewowe noworodków w kierunku rzadkich wrodzonych chorób metabolicznych (takich jak choroba syropu klonowego, tyrozynemia, cytrulinemia, acydurie organiczne, zaburzenia utleniania kwasów tłuszczowych) pozwalają na wykrywanie wad na wczesnym etapie życia oraz dają możliwość szybkiego wdrożenia leczenia w znacznym stopniu zmniejszającego niepełnosprawność i śmiertelność.

Zastosowania

Ostatnie lata zaowocowały intensywnym rozwojem nowych metod opartych na pobraniu krwi w formie DBS. Między innymi można tu wymienić wspomniane wcześniej oznaczenia stężenia aminokwasów, ale także acylokarnityn, prostaglandyn, cytokin, przeciwciał (w tym przeciwciał anty-SARS-CoV-2), lipidów, enzymów, hormonów, markerów nowotworowych, witamin, pierwiastków śladowych, leków i narkotyków. Trwają również prace nad wykorzystaniem DBS do badań cytometrycznych leukocytów.

Ostatnie lata zaowocowały intensywnym rozwojem nowych metod opartych na pobraniu krwi w formie DBS. Między innymi można tu wymienić wspomniane wcześniej oznaczenia stężenia aminokwasów, ale także acylokarnityn, prostaglandyn, cytokin, przeciwciał (w tym przeciwciał anty-SARS-CoV-2), lipidów, enzymów, hormonów, markerów nowotworowych, witamin, pierwiastków śladowych, leków i narkotyków. Trwają również prace nad wykorzystaniem DBS do badań cytometrycznych leukocytów.

Inne ważne zastosowania DBS obejmują metody molekularne DNA/RNA, badania immunologiczne oraz oceny żywieniowe niemowląt, dzieci i dorosłych. Wraz z postępem w testach immunologicznych i technikach molekularnych metody oparte na DBS są obecnie używane do wykrywania antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B, przeciwciał przeciwko antygenowi rdzeniowemu HBV i przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (antygenu -HCV), wykrywania RNA wirusa HCV i antygenu 1-p24 ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) oraz przeciwciał anty-HIV 1/2. Do detekcji służą w pełni zautomatyzowane platformy lub czułe jakościowe testy kwasów nukleinowych.

Inne potencjalne i pojawiające się zastosowania DBS to badania toksykokinetyczne i farmakokinetyczne, profilowanie metaboliczne, monitorowanie leków terapeutycznych, toksykologia sądowa lub kontrola skażenia środowiska. Opracowano już protokoły DBS dla kilku analitów leków, takich jak acetaminofen, aspiryna, bosentan, kofeina, diazepam, omeprazol, prokaina, walsartan i metformina, ułatwiające terapeutyczne monitorowanie tych leków. Poza tym DBS stosuje się do wykrywania wielu pośrednich produktów metabolicznych, takich jak kwasy żółciowe, karnityna, kreatynina, warianty hemoglobiny i homocysteina.

Istotną kwestią jest również możliwość wykorzystania techniki suchej kropli krwi do badań prowadzonych na zwierzętach. Pozwala w znacznym stopniu ograniczyć ilość pobranego materiału, stres, ból i dyskomfort związany z niezbędnymi procedurami badawczymi.

Sucha kropla krwi to jednak dopiero początek rewolucji w rozwoju alternatywnych systemów do pobierania materiału badanego.

Czytaj więcej o dostępnych na rynku systemach mikropróbkowania.
Literatura:
  • „Badania przesiewowe noworodków w Polsce, 2018 rok”
    Postępy Neonatologii, 2018, 24(2); doi: 10.31350/postepyneonatologii/2018/2/PN2018025
  • „Badania przesiewowe noworodków w populacji polskiej”
    Medycyna Ogólna i Nauki o Zdrowiu, 2016, 22(3), 169–175; doi: 10.5604/20834543.1220516
  • „Ivar Christian Bang (1869-1918), founder of modern clinical microchemistry”
    Clinical Chemistry, 1986, 32(1), 213–215; doi: 10.1093/clinchem/32.1.213
  • „Some critical considerations on the serum diagnosis of syphilis”
    Experimental Biology and Medicine, 1909, 6(3), 77–81; doi: 10.3181/00379727-6-36
  • „Dried Blood Spots: Applications and Techniques”
    pod redakcją Wenkui Li, Mike S. Lee
  • „Clinical chemistry and dried blood spots: increasing laboratory utilization by improved understanding of quantitative challenges”
    Bioanalysis, 2014, 6(21), 2791–2794; doi: 10.4155/BIO.14.237
  • „Official International Association for Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology Guideline: Development and Validation of Dried Blood Spot-Based Methods for Therapeutic Drug Monitoring”
    Therapeutic Drug Monitoring, 2019, 41(4), 409-430; doi: 10.1097/FTD.0000000000000643
  • „Dried blood spots: Effects of less than optimal collection, shipping time, heat, and humidity”
    American Journal of Human Biology, 2020, 32(5), e23390; doi: 10.1002/ajhb.23390
  • „A review of microsampling techniques and their social impact”
    Biomedical Microdevices, 2019, 21(81); doi: 10.1007/s10544-019-0412-y
  • „Tutorial: Volumetric Absorptive Microsampling (VAMS)”
    Analytica Chimica Acta, 2018, 1046, 32-47; doi: 10.1016/j.aca.2018.09.004
  • „Dried blood spots: Concepts, present status, and future perspectives in bioanalysis”
    Drug Testing and Analysis, 2014, 6(5), 399-414; doi: 10.1002/dta.1646
  • „Cell Analysis from Dried Blood Spots: New Opportunities in Immunology, Hematology, and Infectious Diseases””
    Advanced Science News, 2021, 8, 2100323; doi: 10.1002/advs.202100323
  • „Sensitive Detection of SARS-CoV-2–Specific Antibodies in Dried Blood Spot Samples”
    Emerging Infectious Diseases, 2020, 26(12); doi: 10.3201/eid2612.203309
  • „Human Saliva Collection Devices for Proteomics: An Update”
    International Journal of Molecular Science, 2016, 17, 846; doi: 10.3390/ijms17060846
  • „Guidelines for the Shipment of Dried Blood Spot Specimens”
    CDC, Infant Screening, 1993, 16(1);