Technika suchej kropli krwi
Technika suchej kropli krwi (DBS, ang. dried blood spot) jest alternatywnym dla wkłucia żylnego sposobem pobrania krwi do badań diagnostycznych. Polega ona na nakłuciu opuszki palca lub pięty (w przypadku noworodków i niemowląt ważących poniżej 10 kg) i naniesieniu krwi włośniczkowej na nośnik w postaci specjalnej bibuły. Nakłucie wykonuje się przy użyciu jednorazowego nakłuwacza. Krew pobraną na bibułę należy suszyć w temperaturze pokojowej, w pozycji poziomej przez około 2-3 godziny. Tak przygotowana, wysuszona próbka może być transportowana lub przeznaczona bezpośrednio do badań diagnostycznych.Unikalne właściwości suchej kropli krwi
-
Niska inwazyjność:
Pobranie krwi włośniczkowej jest dogodną metodą uzyskiwania materiału do badań diagnostycznych u dzieci, osób starszych, otyłych, niepełnosprawnych umysłowo, jak również u wszystkich odczuwających lęk przed igłą.
Stanowi dobre rozwiązanie, gdy z powodu problemów ze znalezieniem żył bardzo trudno jest dokonać wkłucia dożylnego.
Dodatkowo pobranie z opuszki palca może być wskazane u osób intensywnie trenujących, ze względu na brak konieczności rezygnowania z treningu w dniu pobrania. -
Niewielka ilość materiału badanego:
Do wykonania badania wystarczy kropla krwi o objętości 25-75 µl, co odpowiada plamie krwi na bibule o średnicy 8-14 mm. Jest to niezwykle ważne w przypadku noworodków, osób wymagających stałej kontroli laboratoryjnej lub pacjentów w ciężkim stanie. -
Możliwość pobrań w domu i przez osoby bez przygotowania medycznego:
Możliwość samodzielnego pobrania w domu może mieć istotne znaczenie dla pacjentów z obniżoną odpornością, u których wizyta w punkcie pobrań może stanowić dodatkowe zagrożenie.
Pobranie DBS jest dobrym rozwiązaniem dla osób z ograniczoną możliwością poruszania się.
Stanowi ułatwienie prowadzenia badań przesiewowych na dużych populacjach w warunkach braku dostępu do specjalistycznego zaplecza medycznego. -
Wysoka stabilność analitów:
Wysuszenie krwi na bibule hamuje lub nawet zatrzymuje szybkość procesów metabolicznych, co pozwala na uzyskanie dłuższej stabilności badanych związków. -
Niska zakaźność w transporcie i obróbce:
Wysuszenie materiału powoduje dezaktywację wirusa HIV oraz zapobiega transmisji wirusa HBV - dopiero zawieszenie w cieczy może wiązać się z ryzykiem potencjalnego przeniesienia wirusa, ale tylko w przypadku, jeśli doszłoby do bezpośredniego przeniesienia zainfekowanej cieczy do krwiobiegu osoby narażonej. -
Łatwy i niewymagający transport/przechowywanie:
Możliwość transportu i przechowywania większej ilości próbek z wykorzystaniem tej samej przestrzeni.
Ryzyko uszkodzenia lub zanieczyszczenia próbek DBS jest minimalne.
Nie jest wymagane zapewnienie szczególnych warunków środowiskowych podczas transportu i krótkoterminowego przechowywania próbek.
Ograniczenia w wykorzystaniu suchej kropli krwi
- choroby mające wpływ na wielkość hematokrytu (np. niedokrwistości, czerwienice, odwodnienia, przewodnienia)
- ograniczona ilość badań opracowanych z suchej kropli krwi
- konieczność posiadania specjalistycznej aparatury pomiarowej
- potrzeba zatrudniania wysoce wykwalifikowanego personelu
- wydłużony czas oczekiwania na wynik (transport do i od pacjenta)
-
możliwe błędy w pobraniu:
- - zbyt mała ilość materiału
- - nieprawidłowa jakość materiału (np. wielokrotne nakładanie materiału w to samo miejsce, nieprawidłowe przesączenie, niewłaściwe warunki suszenia)
- - możliwość zanieczyszczenia materiału w czasie pobierania (np. środki pielęgnujące skórę dłoni, zanieczyszczenia powierzchni)
Przeciwwskazania do pobierania materiału w formie DBS
- odwodnienie, przewodnienie
- niskie ciśnienie krwi z zaburzeniami krążenia obwodowego
- obecność zmian skórnych w postaci zgrubień, zrogowaceń, owrzodzeń lub pęcherzy w planowanym miejscu nakłucia
- małopłytkowość lub nieprawidłowości w budowie płytek krwi, zaburzenia krzepnięcia
- niedokrwistość i czerwienica
- obecność obrzęków obwodowych
Kamienie milowe w rozwoju badań opartych na technice DBS
Pierwsze medyczne zastosowania suchej kropli krwi datuje się na początek XX wieku. W 1907 roku Ivar Christian Bang po raz pierwszy wspomniał o wykorzystywaniu krwi naniesionej na specjalny papier filtracyjny w badaniach stężenia glukozy. Pierwsza publikacja na ten temat pojawiła się w 1913 roku. Ostatecznie Bang został uznany za pioniera i twórcę współczesnej mikrochemii klinicznej.
Równolegle, w 1911 roku, Noguchi opracował wersję testu Wassermana. Badając obecność przeciwciał skierowanych przeciw Treponema pallidum (bakterii wywołującej kiłę) w surowicy pacjentów, wykorzystał bibułę filtracyjną jako nośnik dla antygenu.
Do 1939 roku prowadzono już intensywne badania nad wykorzystaniem bibuł filtracyjnych jako podłoża do pobierania próbek na badania serologiczne. Eksperymenty prowadzono dla różnych rodzajów bibuł, metod ekstrakcji, czynników zewnętrznych i stabilności materiału w transporcie.
Przełom lat 50. i 60. był znaczący dla badań opartych na suchej kropli krwi. W 1957 roku pojawiły się doniesienia o wykorzystaniu materiału pobranego na bibułę filtracyjną w diagnostyce wschodniego końskiego zapalenia mózgu. W tym samym roku po raz pierwszy zastosowano urządzenie do wycinania wystandaryzowanych krążków, a rok później wykorzystano bibułę do pobrania moczu w badaniach wczesnego wykrywania fenyloketonurii u noworodków. Natomiast lata 1961-63 zapoczątkowały nową erę badań przesiewowych. Opracowanie przez Roberta Guthrie w 1961 roku i opublikowanie w 1963 roku metody analitycznej umożliwiającej oznaczenie fenyloalaniny w suchej kropli krwi pozwoliło na prowadzenie badań na nieznaną wcześniej skalę.
Koniec lat 90. okazał się kolejnym przełomem w diagnostyce opartej na suchej kropli krwi. Pomysł wykorzystania tandemowej spektrometrii mas do wieloparametrowych analiz z jednego krążka bibuły otworzył nowe perspektywy przed badaniami przesiewowymi. Umożliwił oznaczenie szerokiej gamy substancji w czasie jednej analizy, znacząco skracając czas badań oraz - ze względu na wysoką stabilność analitów na bibule - skutkował możliwością obejmowania badaniami całych populacji.
Badania przesiewowe noworodków w kierunku rzadkich wrodzonych chorób metabolicznych (takich jak choroba syropu klonowego, tyrozynemia, cytrulinemia, acydurie organiczne, zaburzenia utleniania kwasów tłuszczowych) pozwalają na wykrywanie wad na wczesnym etapie życia oraz dają możliwość szybkiego wdrożenia leczenia w znacznym stopniu zmniejszającego niepełnosprawność i śmiertelność.
Zastosowania suchej kropli krwi
Ostatnie lata zaowocowały intensywnym rozwojem nowych metod badań wykonywanych z DBS. Wśród nich można wymienić oznaczenia stężenia aminokwasów, acylokarnityn, prostaglandyn, cytokin, przeciwciał (np. anty-SARS-CoV-2), lipidów, enzymów, hormonów, markerów nowotworowych, witamin, pierwiastków śladowych, leków i narkotyków. Trwają również prace nad wykorzystaniem DBS do badań cytometrycznych leukocytów.
Inne ważne zastosowania DBS obejmują metody molekularne DNA/RNA, badania immunologiczne oraz oceny żywieniowe dzieci i dorosłych. Wraz z postępem w testach immunologicznych i technikach molekularnych metody oparte na DBS są obecnie używane do wykrywania antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B, przeciwciał przeciwko antygenowi rdzeniowemu HBV i przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (antygenu-HCV), wykrywania RNA wirusa HCV i antygenu 1-p24 ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) oraz przeciwciał anty-HIV. Do detekcji służą w pełni zautomatyzowane platformy lub czułe jakościowe testy kwasów nukleinowych.
Badania z suchej kropli krwi umożliwiają też wykrywanie czynników zakaźnych. Wczesne zastosowania DBS obejmują testy serologiczne do diagnozowania kiły czy wykrywanie przeciwciał przeciwko odrze, śwince, wirusowi polio, wirusowi grypy rzekomej, syncytialnemu wirusowi nabłonka oddechowego.
Potencjalnymi zastosowaniami DBS są także badania toksykokinetyczne i farmakokinetyczne, badania zespołów metabolicznych, monitorowanie terapeutyczne leków, toksykologia sądowa i kliniczna oraz kontrola skażenia środowiska. Do tej pory opracowano protokoły DBS dla leków takich jak acetaminofen, aspiryna, bosentan, kofeina, diazepam, omeprazol, prokaina, walsartan i metformina. Poza tym DBS stosuje się do wykrywania wielu pośrednich produktów metabolicznych, np. kwasów żółciowych, karnityny, kreatyniny i homocysteiny, a także wariantów hemoglobiny.
Istotną kwestią jest również możliwość wykorzystania techniki suchej kropli krwi do badań prowadzonych na zwierzętach. Pozwala w znacznym stopniu ograniczyć ilość pobranego materiału, stres, ból i dyskomfort związany z niezbędnymi procedurami badawczymi.
Sucha kropla krwi to jednak dopiero początek rewolucji w rozwoju alternatywnych systemów do pobierania materiału badanego.
-
„Ivar Christian Bang (1869-1918), founder of modern clinical microchemistry”
Clinical Chemistry, 1986, 32(1), 213–215; doi: 10.1093/clinchem/32.1.213 -
„Some critical considerations on the serum diagnosis of syphilis”
Experimental Biology and Medicine, 1909, 6(3), 77–81; doi: 10.3181/00379727-6-36 -
„Dried Blood Spots: Applications and Techniques”
pod redakcją Wenkui Li, Mike S. Lee -
„Clinical chemistry and dried blood spots: increasing laboratory utilization by improved understanding of quantitative challenges”
Bioanalysis, 2014, 6(21), 2791–2794; doi: 10.4155/BIO.14.237 -
„Official International Association for Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology Guideline: Development and Validation of Dried Blood Spot-Based Methods for Therapeutic Drug Monitoring”
Therapeutic Drug Monitoring, 2019, 41(4), 409-430; doi: 10.1097/FTD.0000000000000643 -
„Dried blood spots: Effects of less than optimal collection, shipping time, heat, and humidity”
American Journal of Human Biology, 2020, 32(5), e23390; doi: 10.1002/ajhb.23390 -
„A review of microsampling techniques and their social impact”
Biomedical Microdevices, 2019, 21(81); doi: 10.1007/s10544-019-0412-y -
„Tutorial: Volumetric Absorptive Microsampling (VAMS)”
Analytica Chimica Acta, 2018, 1046, 32-47; doi: 10.1016/j.aca.2018.09.004 -
„Dried blood spots: Concepts, present status, and future perspectives in bioanalysis”
Drug Testing and Analysis, 2014, 6(5), 399-414; doi: 10.1002/dta.1646 -
„Cell Analysis from Dried Blood Spots: New Opportunities in Immunology, Hematology, and Infectious Diseases””
Advanced Science News, 2021, 8, 2100323; doi: 10.1002/advs.202100323 -
„Sensitive Detection of SARS-CoV-2–Specific Antibodies in Dried Blood Spot Samples”
Emerging Infectious Diseases, 2020, 26(12); doi: 10.3201/eid2612.203309 -
„Human Saliva Collection Devices for Proteomics: An Update”
International Journal of Molecular Science, 2016, 17, 846; doi: 10.3390/ijms17060846 -
„Guidelines for the Shipment of Dried Blood Spot Specimens”
CDC, Infant Screening, 1993, 16(1);
